Йодантипирин | Главная | Специалистам | Клещевой энцефалит | СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ КЛЕЩЕВОМ ЭНЦЕФАЛИТЕ |

Успехи, достигнутые в клинической иммунологии за последние годы, позволили к настоящему времени выявить нарушения иммунной системы при различных вирусных инфекциях, в том числе при клещевом энцефалите (КЭ) [4]. Известно, что многие вирусы могут модулировать рецепторный аппарат лимфоцитов, вызывая снижение аффинности рецепторов лимфоцитов в связи с блокировкой и угнетением их экспрессии [11]. Восстановление аффинности рецепторов может происходить после воздействия различных иммунотропных лекарственных средств, вызывающих деблокировку рецепторов. В связи с этим значительный интерес представляет использование при вирусных инфекциях иммунорегуляторных пептидов и интерферонов — перспективных иммуномодуляторов с разнообразным спектром иммунотропного действия [2, 6, 12, 14]. Сравнительное изучение этих веществ при КЭ представляется весьма перспективным как для обеспечения выбора наиболее оптимального препарата индивидуально для каждого больного, так и в плане отработки схем иммунокоррекции. Целью нашей работы явилось сравнительное изучение влияния различных известных и менее изученных пептидов и интерферонов на экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов под действием вируса КЭ.

В работе использовали донорскую кровь II группы. Объектом изучения служили мононуклеары, выделенные из крови путем центрифугирования на слое фиколла и верографина по методике [9]. Клетки в объеме 100 мкл (2 • 10⁶ клеток/мл) культивировали в питательной среде 199 с добавлением 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки эмбрионов телят (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, Москва). Культивирование осуществляли в течение 24 ч в термостате в атмосфере СО_2. Жизнеспособность клеток определяли в тесте с трипановым синим в течение всего хода эксперимента (она составляла не менее 95%).

В работе использовали штамм 18 вируса КЭ, выделенный лабораторией КЭ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН в 1977 г. из крови больного. Этим штаммом вируса КЭ в дозе 2 lg ТЦД₅₀ и в объеме 10 мкл заражали приготовленную взвесь мононуклеаров и инкубировали в течение 24 ч.

Для оценки влияния вируса на экспрессию рецепторов лимфоцитов использовали комплекс розеточных методов с определением общих Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) в обычном тесте с эритроцитами барана (ЭБ) [7], "активных" Е-РОК (Е_а-РОК), "стабильных" Е-РОК, формирующих розетки с ЭБ при 37°С (Е_а-РОК), "ауто"-Е-РОК, образующих розетки с аутологичными эритроцитами (Е_ауто-РОК). Регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов выявляли по чувствительности к теофиллину: теофиллинчувствительные (ТЧ-РОК) и теофиллинрезистентные (ТР-РОК) розетки. Количество В-лимфоцитов определяли по способности лимфоцитов формировать розетки с эритроцитами мыши (М-РОК) [7].

Препараты, использованные в работе, приведены в табл. 1. Обработку лимфоидных клеток препаратами проводили в двух вариантах опыта: 1) клетки инкубировали в питательной среде с одним из препаратов в течение 30 мин, затем добавляли вирус КЭ и продолжали инкубацию с вирусом в течение 24 ч; 2) клетки инкубировали в питательной среде с вирусом КЭ в течение 24 ч, затем на 30 мин добавляли один из препаратов. Полученные результаты сравнивали с показателями контролен А и Б. Контроль А — клетки, инкубированные в питательной среде в течение 24 ч без вируса и без исследуемых препаратов. Количество Е-РОК, полученных при данных условиях культивирования, принимали за исходный уровень (100%). Контроль Б — клетки, инкубированные в питательной среде с вирусом КЭ в течение 24 ч. В данном случае количество Е-РОК принимали за 0%.

Статистическую обработку полученных данных проводили с учетом г-критерия Стьюдента.

Первоначально нами было изучено влияние вируса КЭ на экспрессию маркеров субпопуляций лимфоцитов (табл. 2). Как видно из представленных данных, под действием вируса происходит достоверное снижение количества общих Е-РОК на 21,2 ± 1,3% (р < 0,05), высокоаффинных или "активных" Е-РОК - в пределах 9,4 ± 0,8% (р < 0,05), ТР-РОК - на 16,1 ± 1,6% (р < 0,05). Экспрессия маркеров других субпопуляций лимфоцитов под действием вируса КЭ не изменялась.

Полученные нами данные о модифицирующем влиянии вируса КЭ на рецепторы Т-клеток согласуются с данными других авторов, отмечающих транзиторный дефицит Т-лимфоцитов в остром периоде КЭ [4, 10]. При этом существенное уменьшение популяции Т-клеток является результатом изменения рецепторных структур Т-лимфоцитов, пораженных вирусом КЭ [10].

Для восстановления сниженной вирусом КЭ экспрессии рецепторов Т-лимфоцитов использовали 14 официнальных препаратов, обладающих в разной степени иммуномодулирующими свойствами. Препараты добавляли к лимфоидным клеткам до и после заражения вирусом, имитируя "профилактическое" и "лечебное" введение препаратов (рис. 1, а, б).

В 1-ю группу этиотропных средств входили официнальные препараты, которые, как правило, применяют в остром периоде КЭ, — это рибонуклеаза (№ 1) и противоэнцефалитный иммуноглобулин (№ 2). Нами было показано, что обработка лимфоидных клеток рибонуклеазой по профилактической схеме не предотвращает снижения уровня экспрессии рецепторов к ЭБ, вызванного вирусом КЭ (см. рис. 1, о), а при лечебной схеме применения препарата не восстанавливает угнетение вирусом экспрессии Е-рецепторов (см. рис. 1, б).

Влияние вируса КЭ на экспрессию рецепторов лимфоцитов

Примечание. * — достоверность различий (р < 0,05).

Из данных литературы известно [13], что чувствительность организма к воздействию лекарственных препаратов в значительной мере носит генетический характер и тесным образом ассоциирована с аллелями генов HLA-комплекса. Так показано [13], что возможен неблагоприятный эффект от применения рибонуклеазы у лиц с фенотипами АЗ/В7, А10/В18, A3, 10, Исходя из этого, можно предположить, что отсутствие влияния рибонуклеазы на Е-рецептор Т-лимфоцитов связано с индивидуальной чувствительностью клеток к этому препарату.

Применение противоэнцефалитного иммуноглобулина (№ 2) дало выраженный профилактический и лечебный эффект. На рис. 1, а видно, что обработка иммуноглобулином лимфоидных клеток до заражения, вирусом полностью (100%) защищает от угнетения Е-розеткообразование Т-лимфоцитов. На рис. 1, б показано, что применение иммуноглобулина после 24-часовой инкубации вируса с клетками увеличивает процент Е-РОК на 67,3 ± 4,3%.

Судя по данным литературы [5], действие специфических иммуноглобулинов носит разносторонний характер. Связывание, сегрегация и деградация субстанций — лишь одна из сторон биологической активности специфических иммуноглобулинов. С другой стороны, иммуноглобулины обладают рядом свойств иммуномодуляторов, лечебное действие которых, как полагает автор [5], сопряжено с изменением баланса активности популяций Tx1 и Тх2.

Ко 2-й группе исследуемых веществ относятся иммунорегуляторные пептиды различного происхождения: тималин (№ 3) — тимусного происхождения, миелопид (№ 4) — костномозгового происхождения, ликопид (№ 5) — синтетический пептид микробного происхождения, ганглиин (№ 6) — пептид из оптических ганглиев кальмара. Введение в культуру лимфоидных клеток миелопида, ликопида и ганглиина по профилактической схеме предохраняло от снижения вирусом КЭ уровня экспрессии Е-рецепторов Т-лимфоцитов в среднем на 52,3 + 4,6%. Достоверной разницы между этими препаратами не отмечено. Обращает на себя внимание действие тималина, который при таком способе применения практически не защищал Е-рецепторы от влияния вируса. Внесение пептидов после инкубации с вирусом формирует иную картину: из всех вышеназванных пептидов лишь один тималин восстанавливал экспрессию Е-рецепторов Т-лимфоцитов до исходного уровня, т. е. на 100%. остальные пептиды не восстанавливали сниженные вирусом показатели Е-розеткообразования (см. рис. 1, а, б).

Такой эффект действия пептидов тимического и костномозгового происхождения зависит от их непосредственного влияния на Т- и В-лимфоциты [13], тогда как действие пептидов микробного происхождения и ганглиина, поданным работ [12], направлено на клетки моноцитарно-макрофагальной системы. Подтверждение высокого лечебного эффекта тималина в эксперименте на белых мышах, зараженных вирусом КЭ, было показано нами ранее [8].

К 3-й группе исследуемых препаратов относятся индукторы интерферона — акриданоны (циклофе-рон — № 7 и неовир — № 8) и 4-йодантипирин (№ 9). Из препаратов этой группы при внесении их в клеточную суспензию до заражения максимальную активность проявлял 4-йодантипирин, на 100% предотвращая снижение вирусом КЭ экспрессии Е-рецепторов Т-лимфоцитов. При использовании неовира розеткообразующая способность сохранялась у 61,8 ± 3,3% клеток. При использовании этих препаратов после инкубации с вирусом максимальную активность проявлял также 4-йодантипирин, восстанавливая до 60,2 ± 2,5%

Здесь и на рис. 2: по осям ординат: — количество Е-РОК (8 %); по осям абсцисс — контроль А, контроль Б, номера препаратов (список препаратов дан в табл. 1).

Е-розеткообразование клеток, в то время как циклоферон и неовир в этих условиях не оказывали практически никакого действия на сниженное количество Е-рецепторов Т-лимфоцитов.

Несмотря на то, что циклоферон и неовир относятся к одной группе эндогенных индукторов интерферона — акриданонам, эти препараты являются разными солями незамещенной акридонуксус-ной кислоты — натриевой (неовир) и N-метилглю-каминовой (циклоферон) [14]. Различаются они и по спектру биологического действия: неовир — индуктор эндогенных интерферонов классов аир, а циклоферон — индуктор α-, β, γ-интерферонов [2, 3, 14]. Кроме того, различное действие циклоферона и неовира на рецепторный аппарат Т-лимфоцитов может быть обусловлено и генотипическими особенностями организма.

Можно предположить, что выраженный "профилактический" и "лечебный" эффект 4-йодантипирина связан не только с тем, что он является индуктором интерферона, но и с его стабилизирующим действием на биологические мембраны, что может обусловить при профилактическом введении торможение проникновения вируса в клетку [15].

К 4-й группе препаратов относятся рекомбинантные интерфероны — реаферон (№ 10) и роферон А (№ 11). Применение указанных препаратов по результатам этого теста оказалось малоэффективным. Так, при их "профилактическом" введении угнетение экспрессии Е-рецепторов не предотвращалось. Обработка рофероном А лимфоидных клеток после инкубации с вирусом приводила к восстановлению розеткообразующей способности Т-лимфоцитов на 47,6 ± 2,9%, в то время как реаферон не вызывал увеличения процента Е-РОК.

В 5-ю группу веществ входили природные интерфероны: человеческий лейкоцитарный — ЧЛИ (№ 12), лейкинферон — ЛФ (№ 13) и велферон (№ 14). Внесение этих препаратов до заражения Т-лимфоцитов оказалось весьма эффективным — максимальное действие оказывал ЛФ — на 100% защищал Е-рецепторы. Близок к нему и велферон, достоверного различия между препаратами не обнаружено (р < 0,05). Однако эти препараты при внесении после заражения не восстанавливали сниженный вирусом уровень экспрессии Е-рецепторов; в то же время профилактическое и лечебное воздействие ЧЛИ превышало процент розеткообразующих клеток (соответственно на 47,6 ± 3,1 и 67,6 + 3,7%).

По данным В. П. Кузнецова и соавт. [6], совместное использование ЛФ и ЧЛИ значительно повышает эффект лечения при различных вирусных инфекциях. Нами также была предпринята попытка сочетанного применения этих препаратов в разных вариациях (см. табл. 1, рис. 2). Как видно на рис. 2, сочетанное применение ЛФ и ЧЛИ до заражения предохраняет 52,4 ± 3,8% розеткообразующих Т-лимфоцитов, в то время как введение ЛФ и ЧЛИ после заражения восстанавливает до исходного уровня (т. е. на 100%) сниженную вирусом экспрессию Е-рецепторов Т-лимфоцитов.

Таким образом, сопоставляя эффективность различных препаратов по их способности влиять на Е-розеткообразование Т-лимфоцитов, зараженных вирусом КЭ, мы установили, что при "профилактическом" введении препаратов наиболее выраженное

защитное действие (на 100% предотвращающее снижение уровня экспрессии Е-рецепторов клеток) оказывают противоэнцефалитный иммуноглобулин, 4-йодантипирин и ЛФ. При использовании "лечебной" схемы введения препаратов эффективными оказались следующие вещества: противоэнцефалитный иммуноглобулин, 4-йодантипирин, роферон А, ЧЛИ. Однако вышеперечисленные препараты восстанавливали сниженный вирусом уровень экспрессии рецепторов Т-лимфоцитов лишь на 50—60%, в то время как 100% восстановление рецепторов обеспечивалось при использовании тималина и при совместном применении ЛФ и ЧЛИ.

В заключение следует еще раз подчеркнуть различное влияние испытанных препаратов на розеткообразующую способность лимфоцитов крови человека. Полученные данные указывают на возможность расширения спектра иммунокорректоров для профилактического и лечебного применения при КЭ. Необходимо учитывать, что эффективность препаратов была изучена in vitro. Это, с одной стороны, не отражает полной картины их воздействия на макроорганизм, хотя с другой — получена реальная возможность быстрого определения наибольшей активности некоторых лекарственных средств индивидуально для каждого больного. Дальнейшие подобные исследования на материале больных КЭ позволят сделать окончательный вывод о возможности подбора высокоактивных иммунокорректоров в комплексной терапии этой инфекции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гожа А. К. Иммуноактивный пептид из оптических ганглиев кальмара: Автореф. дис.... канд. мед. наук. — Владивосток, 1994.

2. Ершов Ф. Я. Система интерферона в норме и при патологии. — М., 1996.

3. Ершов Ф. И., Романцев М. Г. и др. Циклоферон 12.5% для инъекций: итоги и перспективы клинического применения. - СПб., 1999.

4. Кветкова Э. А. Вирусологические и иммунологические аспекты патогенеза клещевого энцефалита: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Л., 1984. - С. 1-35.

5. Климович В. Б. Регуляторные эффекты иммуноглобулинов // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 50—53.

6. Кузнецов В. П., Караулов А. В. Лейкинферон — механизмы терапевтического действия и тактика иммунокоррекции // Int. J. Immunorehabilitation. - 1998. — № 10. - С. 66—74.

7. Лебедев К. И., Понякина И. Д. Иммунограмма в клинической практике. — М., 1990.

8. Любимова Н. Б., Леонова Г. Н., Мураткина С. М. Гормоны тимуса в лечении и профилактике флавивирусной инфекции в условиях эксперимента // Журн. микробиол. — 1995. — № 5. - С. 105-108.

9. Новиков Д. К, Новикова В. И. Оценка иммунного статуса. — М.; Витебск, 1996. - С. 194-215.

10. Погодина В. В., Фролова М. П., Ерман Б. А. Хронический клещевой энцефалит. — Новосибирск, 1986.

11. Семенов Б. Ф. Иммуномодуляция при вирусных инфекциях и вакцинации // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Вирусология. — 1989. — Т. 17.

12. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах // Иммунология. - 1996. - № 6. - С. 4-9.

13. Черницына Л. О., Коненков В. И., Иерусалимский А. П. Оценка эффективности применения различных методов лечения клещевого энцефалита в остром периоде // Журн. невропатол. и психиатр. — 1992. — Т. 92.

15. Яворская В. Е., Саратиков А. С, Федоров Ю. В. И др. Лечебный и профилактический эффект 4-йодантипирина при экспериментальном клешевом энцефалите // Вопр. вирусол. - 1994. - N° 3. - С. 136-138.

Все новости | Версия для печати