Материалы и методы. Вирус. Использован вирус Коксаки ВЗ (штамм Nancy), полученным из коллекции вирусов института вирусологии им. Д. И. Ивановского, адаптированный к новорожденным мышам. Титр вируса составил 4,0 lg ЛД₅₀ 0,2 мл.

Культура клеток. Перевиваемая линия клеток L-41 получена из Томского НИИ вакцин и сывороток. Клетки культивировали в среде. Игла с 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и 0,1% гентамицина.

Животные. Экспериментальную инфекцию воспроизводили путем подкожного введения вируссодержащей жидкости в объеме 0,02 мл (10 ЛД₅₀) новорожденным нелинейным мышам массой 0.9 г в область межлопаточного бурого жира.

Препарат. 4 - Йодантипирин (получен oт проф. А.С. Сара­кова, которому авторы выражают искреннюю признательность) вводили мышам внутримышечно в заднюю лапку и 1% крахмальном геле в дозе 50 мкг г и в объеме 0,2 мл по двум схемам — лечебной и профилактической. По лечебной схеме препарат вводили через 1 ч после инфицирования животных вирусом и далее 1 раз в сутки в течение 2 нед.

Результаты испытаний лечебного действия 4 – йодантипирина при экспериментальной Коксаки В3 - инфекции

Профилакти­ческая схема включала двукратное введение 4-йодантипирина за 24 и 1 ч до заражения. Во всех экспериментах были преду­смотрены контрольные группы животных: 1-я группа - инфицированные вирусом Коксаки В3 с введением плацебо: 2-я группа - введение плацебо (интактные животные). Наблюде­ние за животными вели в течение 60 сут.

Оценки противовирусной активности. Определяли процент летальности, среднюю продолжительность жизни (СПЖ) [7], изменение массы тела животных, а также содержание вируса и наличие морфологических изменений в тканях мышей из экспериментальных групп.

Вирусологические методы. Вирус Коксаки ВЗ в тканях серд­ца и поджелудочной железы мышей определяли на 3, 5, 7, 14-е сутки от момента заражения путем внесения 10—20% суспен­зии, приготовленной из соответствующих тканей, в культуру клеток L-41 с последующим наблюдением за появлением цитопатического действия и идентификацией реизолированного вируса в реакции нейтрализации [1].

Патоморфологические методы. Мыши выводились из опы­та под эфирным наркозом. Для исследовании ткани сердца и поджелудочной железы фиксировали в 10% формалине, обезвоживали этиловым спиртом восходящей концентрации и заливали в парафин [8]. Срезы тканей толщиной 6 – 8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистическая обработка. Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента при p < 0,05.

Результаты и обсуждение. Лечебное применение 4-йодантипирина (табл. 1) обеспечи­вало выживание 35,3 ± 5,8% мышей, при этом на 7 сут увеличилась СПЖ экспериментальных жи­вотных по сравнению с 1-й контрольной группой. У лечебных мышей наблюдали больший прирост массы тела в течение первых 10 сут эксперимента, чем у инфицированных мышей, не получавших препарат. Результаты вирусологических исследований тканей сердца (рис. 1.а) показали, что пик содержания вируса Коксаки ВЗ как в опытной, так и в контрольной группах приходился на 3-и сутки с момента инфицирования (8,0 и 7,0 lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл соответственно), что согласуется с данными других авторов [6] и соответствует периоду наибольшей гибели животных. С 5-х су­ток наблюдения титр вируса в ткани сердца мы­шей, леченных 4-йодантипирином начинал сни­жаться по сравнению с контролем и к 7-м суткам эксперимента разница между ними составила 1,6 lg. На 14-е сутки из тканей сердца леченых мышей вирус выделить не удалось, тогда как в контрольной группе он еще продолжал обнару­живаться в титре 2,8 lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл. Во многом сходной была динамика содержания вируса Коксаки ВЗ в тканях поджелудочной железы. Пик максимального накопления вируса приходился на 3-и сутки с момента инфицирования, однако к 7-м суткам эксперимента снижение содержания виру­са в тканях поджелудочной железы у леченых животных по сравнению с контрольными (на 2.0 и 5.3 lg соответственно) был еще более выражен­ным, чем в тканях сердца. К 14-м суткам опыта вирус в тканях поджелудочной железы леченых животных не обнаруживали.

Еще более выраженный защитный эффект 4-йодантипирина наблюдали при его введении по профилактической схеме (табл. 2). Так. почти в 3 раза (статистически достоверно) повышалась выживаемость мышей в опытной группе по срав­нению с 1-й контрольной. На 23-и сут. возросла СПЖ животных, получавших препарат. Заметим, что период максимальной гибели животных в опытной группе был сдвинут к концу 1 нед, тогда как в контрольной группе он приходился на 3—4-е сутки с момента инфицирования. Масса тела мышей, получавших 4-йодантнпирин. увели­чилась с 2,9±0,1 (на 3-й сутки) до 5,4 г (на 10-е сутки), тогда как в 1-й контрольной группе - с 2,5 ±0,09 до 3,9 + 0,1 г.

Рис. 1. Динамика содержания вируса Коксаки ВЗ в тканях сердца (1, 1) и поджелудочной железы (2, 2) мышей при изучении лечебного (а) и профилактического (б) действия 4-йодантипирина.

Цифра без штриха – контроль, со штрихом – опыт.

По оси абсцисс – дни с момента заражения. По оси ординат – титр вируса lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл.

Результаты испытаний профилактического действия 4 – йодантипирина при экспериментальной Коксаки В3 - инфекции

Вирусологические исследования тканей сердца и поджелудочной железы (рис. 1.б) животных по­казали, что на 3-и сут инфекции титр вируса Коксаки ВЗ в тканях сердца и поджелудочной железы у подопытных мышей в сравнении с кон­тролем был ниже соответственно на 1,4 и 2.0 lg. К 7-м суткам эксперимента титр вируса в тканях сердца мышей в опыте составил 3.0 lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл, а в тканях поджелудочной желе­зы _2,0 lg ТЦД50/0-' «л, тогда как в 1-й конт­рольной - соответственно 4,3 и 4.7 lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл. На 14-е сутки из сердца и поджелу­дочной железы животных, получавших 4-йодантипирин по профилактической схеме, вирус выде­лить не удавалось, а из органов мышей контроль­ной группы он продолжал выделяться.

В результате патоморфологических исследова­ний установлено, что у мышей, получавших 4-йодантипирин по лечебной и профилактической схемам, а также в группе животных без введения препарата в период с 4-х по 11-е сутки (рис. 2. а) обнаружены дистрофические и некробиотические изменения кардиомиоцитов диффузного характе­ра, множественные микронекрозы миокарда. В ряде случаев отмечалась фрагментация мышеч­ных волокон, наблюдалось исчезновение попереч­ной исчерченности цитоплазмы кардиомиоцитов, гомогенизация цитоплазмы небольших групп мышечных клеток с интенсивным окрашиванием их эозином. Встречались клетки с явлениями мелкоглыбчатого распада саркоплазмы.

Исследования выживших животных через 1 мес после инфицирования (рис. 2. б) показали наличие ингерстициального отека миокарда, часто встре­чались клетки с явлениями гомогенизации и гидропической дистрофии. Следовательно, несмотря на отсутствие выделения вируса из тканей сердца, патологические изменения в нем оставались зна­чительными. В поджелудочной железе мышей с помощью использованных нами методов ис­следования видимых гистологических изменений обнаружить не удалось, что согласуется с данны­ми литературы [10].

Оценивая полученные результаты, считаем воз­можным сделать заключение о том, что 4-йодаптипирин оказывает лечебно-профилактическое действие в острый период экспериментальной Ко­ксаки ВЗ-инфекции, повышая выживаемость. СПЖ животных, не предупреждая, однако, хронизации патологического процесса. Это согласу­ется с имеющимися в литературе данными о дли­тельном нахождении вирусов Коксаки В3 в организме экспериментальных животных [9].

Рис.2 гистологическая картина тканей сердца мышей после заражения вирусом Коксаки ВЗ

В ходе эксперимента нам удалось наблюдать трансплацентарную передачу вируса Коксаки ВЗ потомству от самки, инфицированной в первые сутки жизни и выжившей после лечения 4-йодантипирииом. Уже по внешним признакам 11 роди­вшихся мышат отличались от интактных: имели меньшую массу — 0,8 г (у интактных — около 1 г), были вялыми, только на 7-е сутки жизни начали покрываться шерстью (интактные — на 4-е сутки), к этому сроку масса тела составляла 2.5 г (интактные мыши достигали такой массы к 3-м суткам жизни). Со 2-х суток жизни началась гибель животных и к 15-м суткам летальность составила 100%. Из сердца погибших мышей в культуре клеток L-41 выделен вирус Коксаки ВЗ в титре 1,5 lg ТЦД₅₀/ 0,1 мл. Морфологические изменения тканей сердца этих мышей соответст­вовали вялотекущему миокардиту.

Следовательно, вирус Коксаки ВЗ, который не удавалось изолировать из тканей сердца и подже­лудочной железы половозрелых мышей обычны­ми вирусологическими методами, способен дли­тельно сохраняться в клетках тканей, вызывая развитие хронической латентной инфекции.

Механизм противовирусной активности 4-йодантипирина при лечебном и профилактическом применении в опытах на экспериментальной мо­дели Коксаки ВЗ-вирусной инфекции, по-видимо­му, обусловлен ранее нами установленной сово­купностью интерферониндуцирующей и иммуномодулирующей активности этого соединения [3, 4, 11]. После необходимых предклинических ис­следований 4-йодантипирин может быть реко­мендован для клинических испытаний в качестве противовирусного средства при заболеваниях, обусловленных вирусами Коксаки.